新冠病毒為何更易傳染？冷凍電鏡圖解病毒進(jìn)入細(xì)胞的“鑰匙”

　　新冠病毒的傳染性為何更強(qiáng)?科學(xué)家用“火眼金睛”的冷凍電鏡技術(shù)，終于找到了其背后的原因——新冠病毒的關(guān)鍵刺突蛋白(S蛋白)與人體細(xì)胞的受體蛋白的親和力，要遠(yuǎn)高于SARS-CoV。

　　病毒要進(jìn)入人體細(xì)胞，必須找到人體細(xì)胞上相應(yīng)的受體蛋白，而每個受體好比是一把“鎖”，得有相應(yīng)的“鑰匙”才能打開，而后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。新冠病毒的“鑰匙”就是S蛋白。

　　新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，新冠病毒與宿主細(xì)胞作用的關(guān)鍵刺突蛋白(S蛋白，Spike glycoprotein)備受各研究團(tuán)隊的重視。當(dāng)?shù)貢r間2月15日，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)疫苗研究中心與得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校分子生物科學(xué)學(xué)院合作在生命科學(xué)預(yù)印本平臺bioRxiv發(fā)表文章“Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation”(論文未經(jīng)同行評議)，對新型冠狀病毒的S蛋白進(jìn)行了近原子結(jié)構(gòu)分析。

　　根據(jù)已經(jīng)公開的基因組序列，研究團(tuán)隊合成并純化了新型冠狀病毒S蛋白的膜外部分。隨后用冷凍電鏡獲得純化S蛋白的3207張照片，經(jīng)過3D重建，最終獲得分辨率為3.5 的S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)。

　　通過與SARS病毒的結(jié)構(gòu)比較，研究團(tuán)隊認(rèn)為，新冠病毒的S蛋白結(jié)合人體ACE2(宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2)的親和力要遠(yuǎn)高于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的S蛋白

　　，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強(qiáng)得多。

　　研究團(tuán)隊還測試了幾種已發(fā)布的SARS病毒RBD特異性單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)它們與新冠病毒的S蛋白沒有明顯的結(jié)合，這表明兩種病毒RBD之間的抗體交叉反應(yīng)性可能受到限制。

　　該論文的通訊作者為得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校分子生物科學(xué)學(xué)院副教授Jason S. McLellan。McLellan是研究病毒的專家，此前在中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和埃博拉等病毒的結(jié)構(gòu)方面做了很多非常重要的工作，包括利用冷凍電鏡、X光結(jié)晶學(xué)等技術(shù)分析冠狀肺炎病毒。

　　值得一提的是，這項研究首次提出新冠病毒S蛋白結(jié)合ACE2的親和力要遠(yuǎn)高于SARS-CoV的S蛋白。早在1月21日和1月23日，中科院上海巴斯德研究所研究員郝沛等人、中科院武漢病毒所研究院石正麗等人均發(fā)表論文提到，

　　新型冠狀病毒和SARS病毒一樣，也是通過利用S蛋白結(jié)合人體ACE2蛋白進(jìn)入細(xì)胞。不過，病毒與宿主細(xì)胞作用的關(guān)鍵S蛋白有更大的差異性。

　　郝沛等人還利用分子結(jié)構(gòu)模擬的計算方法，評估了新型冠狀病毒和SARS病毒的S蛋白與人類ACE2分子相互作用的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然新型冠狀病毒的S蛋白與ACE2之間的作用力低于SARS病毒，但是仍然非常強(qiáng)大。“盡管新型冠狀病毒的新結(jié)構(gòu)與ACE2蛋白互作能力，由于丟失的少數(shù)氫鍵有所下降(相比SARS病毒S-蛋白與ACE2的作用有下降)，但仍然達(dá)到很強(qiáng)的結(jié)合自由能(-50.6 kcal/mol)。”

　　而與之相關(guān)的病毒傳染力目前也有眾多團(tuán)隊給出數(shù)據(jù)。近日迄今為止最大規(guī)模新冠肺炎臨床數(shù)據(jù)的分析認(rèn)為，衡量疾病傳染能力強(qiáng)弱的基本傳染數(shù)R0約為3.77，即在沒有防護(hù)措施的情況下每例患者平均會傳染給另外3.77人，同時強(qiáng)于SARS病毒的R0(2.9-3.324)。這也是迄今為止研究團(tuán)隊得出的新冠病毒的最高R0值。

　　值得一提的是，此番破解工作使用了斬獲2017年諾貝爾化學(xué)獎的“冷凍電鏡”。

　　冷凍電子顯微鏡，就是應(yīng)用冷凍固定術(shù)，在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，讓研究者能將生物分子“凍起來”，前所未有地觀察分析運動過程。這一表征對于生命化學(xué)的理解和藥物學(xué)的發(fā)展都有決定性影響，使得生物化學(xué)進(jìn)入一個新的時代。

　　新冠病毒如何入侵人體

　　研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒利用高度糖基化的同源三聚體S蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞。S蛋白經(jīng)歷很多種結(jié)構(gòu)重新排列后將病毒融合進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜。這一過程包括病毒的S1亞基結(jié)合到宿主細(xì)胞受體上，引發(fā)三聚體不穩(wěn)定性的發(fā)生，進(jìn)而造成S1亞基脫落S2亞基形成高度穩(wěn)定的融合后結(jié)構(gòu)。

　　為了接近宿主細(xì)胞受體，S1亞基中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)會經(jīng)歷類似鉸鏈的構(gòu)象移動從而隱藏或者暴露受體結(jié)合的關(guān)鍵位點。在這一過程中S1存在兩種狀態(tài)：“向下(down)”結(jié)構(gòu)代表了受體不可結(jié)合狀態(tài)，而“向上(up)”結(jié)構(gòu)則代表了受體可結(jié)合狀態(tài)，但同時“向上”結(jié)構(gòu)較為不穩(wěn)定。

　　圖B為不同角度新冠病毒S蛋白圖像，RBD“向上”原聚體以帶狀顯示，顏色與圖A相對應(yīng)(綠色)

　　利用已經(jīng)公開的新冠病毒序列的(上圖A)，作者們通過親和層析和凝膠排阻層析進(jìn)行體外蛋白純化，利用冷凍電鏡技術(shù)初步篩選顯示出高顆粒密度的新冠病毒S蛋白圖像。

　　通過收集和分析3207份蛋白顯微影像后，作者們對蛋白進(jìn)行了3D結(jié)構(gòu)重組，重建了一個3.5 分辨率的不對稱三聚體圖像，其中一個RBD存在于“向上”結(jié)構(gòu)中(上圖B)。

　　研究團(tuán)隊通過使用3D可變性功能觀察到了RBD類似鉸鏈的運動，值得注意的是，這種看似隨機(jī)的RBD運動已在與新冠病毒密切相關(guān)的乙型冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV(中東呼吸綜合征冠狀病毒)中被觀察到，同時在與其親屬關(guān)系遠(yuǎn)一些的的甲型冠狀病毒：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的結(jié)構(gòu)表征中也被捕獲到。

　　新冠病毒為什么傳染性更強(qiáng)

　　作者們將新冠病毒的結(jié)構(gòu)與其他幾種冠狀病毒進(jìn)行了比較。2019-nCoV的S蛋白整體結(jié)構(gòu)與SARS病毒S蛋白的整體結(jié)構(gòu)相似，各個結(jié)構(gòu)之間具有高度同源性，它們之間最大的差異是RBD在其各自的“向下”結(jié)構(gòu)中的位置差異。

　　作者們發(fā)現(xiàn)，與SARS病毒相比，新型冠狀病毒中的RBD結(jié)構(gòu)更靠近三聚體的中央部位，處于“向下”構(gòu)象的SARS-CoV的RBD則與相鄰原聚體的N末端域(NTD)緊貼著。

　　其S蛋白中3個RBD中的1個會向上螺旋突出，導(dǎo)致S1亞基的脫落和S2的折疊，從而使S蛋白更容易與宿主受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合。

　　另外，先前有報道發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒與SARS病毒共享形同的宿主細(xì)胞受體ACE2，作者們希望進(jìn)行動力學(xué)方面的檢測以進(jìn)一步確認(rèn)兩者之間的不同。

　　最近的報道表明，2019-nCoV的S蛋白和SARS-CoV的S蛋白有著相同的功能宿主細(xì)胞受體-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)，作者們通過表面等離子共振(SPR)的動力學(xué)手段量化了病毒與該受體的相互作用。

　　令人驚訝的是，通過表面等離子共振技術(shù)(SPR)分析得到的結(jié)果顯示，新冠病毒S蛋白與ACE2的平衡解離常數(shù)KD是15 nM，而SARS病毒S蛋白與ACE2的平衡解離常數(shù)KD達(dá)到了325.8 nM。KD值越大意味解離越多，S蛋白與ACE2的親和力越弱。

　　經(jīng)過計算，新冠病毒S蛋白與ACE2的親和力，是SARS病毒S蛋白與ACE2之間親和力10倍，甚至20倍。

　　因此，研究團(tuán)隊認(rèn)為，可能正是新型冠狀病毒S蛋白與ACE2的高親和力，讓新冠肺炎在人與人之間傳播變得容易。當(dāng)然，還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)這個結(jié)論。

　　研究團(tuán)隊還形成了與新冠病毒的S蛋白胞外域結(jié)合的ACE2的復(fù)合物(上圖B)，并通過高分辨率冷凍電鏡觀察到，它與SARS-CoV的S蛋白和ACE2之間形成的復(fù)合物非常相似。

　　新型冠狀病毒病毒對于ACE2具有高親和性

　　這也說明，新型冠狀病毒侵入宿主的機(jī)制雖然與其他的冠狀病毒科的病毒相似，但傳染性更強(qiáng)。

　　新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13

　　除了SARS病毒之外，新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13在S蛋白中序列同源性高達(dá)96%。但新型冠狀病毒S蛋白最顯著的不同是，其具有S1/S2蛋白酶切割位點的“RRAR”(弗林蛋白酶識別位點)氨基酸序列，而不是像SARS病毒中僅具有單個精氨酸。

　　新冠病毒的這一現(xiàn)象在流感病毒中較為普遍，其中高毒力禽流感病毒和人流感病毒常發(fā)生流感血凝素蛋白的關(guān)鍵位置上產(chǎn)生多聚弗林蛋白酶位點的氨基酸插入。

　　除了在S1/S2連接處的氨基酸殘基差異外，新型冠狀病毒和RaTG13病毒的S蛋白還存在29個氨基酸殘基的差異，其中17個位于受體結(jié)合的RBD部位。

　　團(tuán)隊還分析了全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織(GISAID)數(shù)據(jù)庫中的61個新冠病毒的S序列，發(fā)現(xiàn)在所有保存的序列中只有9個氨基酸取代。這些取代中的大多數(shù)相對保守，預(yù)計不會對新冠病毒的S蛋白結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生重大影響。

　　抗體實驗

　　由于新型冠狀病毒與SARS病毒之間的結(jié)構(gòu)同源性且共用受體，作者們希望對已經(jīng)發(fā)表的SARS病毒的RBD定向單克隆抗體(mAb)對新型冠狀病毒的RBD進(jìn)行交叉反應(yīng)性測試。

　　作者們通過BLI檢測試劑盒評估了SARS-CoV RBD的定向單克隆抗體S230、m396和80R的交叉反應(yīng)性。

　　S230、m396和80R對于新冠病毒沒有明顯結(jié)合

　　但是作者們發(fā)現(xiàn)，盡管兩病毒RBD之間結(jié)構(gòu)高度相似，但是三種SARS病毒的RBD抗體在所測試的濃度(1μM)下，均未檢測到與新冠病毒的RBD的結(jié)合。

　　研究者們認(rèn)為，盡管這三種抗體的表位僅占新冠病毒的RBD表面積的一小部分，但由于觀察不到結(jié)合，可以認(rèn)為針對SARS病毒的的抗體對新冠病毒不一定具有交叉反應(yīng)性，但新型冠狀病毒S蛋白作為未來抗體分離與治療方案的設(shè)計將提供重要參考。